Biología Molecular & Citogenética

Cuaderno de Prácticas

Aquí se describen las prácticas realizadas en 1º de Laboratorio Clínico y Biomédico

Criopreservación

Escrito por KarolinaCepanauskaite 19-12-2017 en Criopreservación. Comentarios (0)

OBJETIVO:

Aprender a congelar células, previamente cultivadas, en un congelador de -80ºC y criopreservarlas después en nitrógeno líquido. 


REACTIVOS:

-Medio de Congelación: FBS, DMSO

-EtOH 70%


MATERIALES:

-Pipetas graduada y auxiliar de pipeteado

-Micropipetas

-Tubos falcon

-Unidades de filtración de distintos volúmenes.

-Tubos y cajas de criopreservación.

-Gradilla para tubos.


EQUIPO:

-Centrífuga


PROCEDIMIENTOS:

-Encender previamente la cabina de flujo laminar y desinfectar con etanol 70%. 

Preparación del medio de congelación.

-Consiste en FBS al que se añade un 10% de DMSO. Este paso se puede llevar a cabo fuera de la cabina de flujo laminar.

-Filtrar el medio de congelación.

-Almacenar en frío y sacar justo antes de resuspender las células en él. 

Recuento celular.

El recuento celular, la concentración y la viabilidad celular se realizarán como vienen descritas en la práctica anterior de conteo. 

Cálculos para determinar el número de viales a congelar. 

-Por lo general se congelarán del orden de 3,5x10^6 de células por vial.

-Para calcular el número de viales a congelar por cultivo, se calculará el número total de células y posteriormente se dividirá entre el número de células por vial.

Criopreservación de células. 

-Una vez calculado el número de viales y de células por vial para la criopreservación, se procede a a misma: 

-Primero se deben etiquetar lo viales de cripreservación, e introducir el cltivo en tubo falcon de 15mL.

-Centrifugar 80x g durante 8 minutos

-Introducir los tubos en la cabina de flujo laminar previamente pulverizados con etanol 70%.

-Con un pipeta pasteur quitar todo el sobrenadante. 

-Resuspender el pellet en el volumen de medio de congelación necesario (1mL de medio de congelación vial).

-Con una pipeta serológica tomar todo el volumen y añadirlo al vial de criopreservación.

-Introducir los viales en el congelador de -20ºC durante 4-5 horas.

-Meter los viales en una de las cajas de criopreservación y llevarlos al congelador de -80ºC o al Deward de nitrógeno líquido.


RESULTADOS:

La práctica salió en buenas condiciones.



Conteo, Concentración y Viabilidad Celular

Escrito por KarolinaCepanauskaite 19-12-2017 en CámaraNeubauer. Comentarios (0)
OBJETIVO:

Calcular la concentración y viabilidad de un cultivo celular.


REACTIVOS:

-Muestra de cultivo

-Disolución al 0.4% de azul tripán

-Dilución PBS


MATERIALES:

- Cámara de Neubauer

- Un contador manual.

-Pipeta serológica graduada de 5.10ml ó 25ml 

-Auxiliar de pipeteado

-Micropipetas según la cantidad que se necesite.

-Tubos Eppendorf.

-Gradilla para tubos


EQUIPOS:

-Cabina de flujo laminar

-Microscopio óptico invertido


PROCEDIMIENTOS:

-Encender la cabina de flujo laminar y desinfectarla con el etanol 70%. 

-Tomar 2μL de muestra de cultivo y añadirlo a un tubo eppendorf, donde se añaden 18μL dilución PBS. Todo ello en la cabina de flujo

laminar. 

-El siguiente paso ya se realiza fuera de la cabina de flujo laminar: añadir 20 μL de azul tripán

-Resuspender con cuidado. 

-Colocar la cámara horizontalmente sobre la mesa

-Añadirle 10μL de la muestra.

-Colocar la punta de la micropipeta en el borde del cubreobjetos, e introducir la muestra entre la cámara y el cubreobjetos desde el lateral.

-Colocar la cámara en la platina del microscopio y enfocarlo hasta que puedan verse nítidas las células.

-Buscar el primer cuadro donde se realice el recuento. (Nosotros decidiremos dónde empezar a contar y de qué forma lo haremos.)

-Contar las células viables, las que están sin teñir o blancas, y las no viables o muertas teñidas de azul. 


La determinación de la concentración celular viene definida por la siguiente ecuación: 

Concentración (células/mL) = (Nº de células por 1000 x factores dilución) / (Nº de cuadros)

La viabilidad celular, viene definida por la ecuación:

Viabilidad celular (OBJETIVO:%)= (Nº de células viables / Nº de células totales) x 100


RESULTADOS:

A nosotras nos ha salido un número muy elevado de células por cada cuadrito de la cámara Neubauer, lo que significa que teniamos que haber echado una mayor cantidad de dilución PBS a la muestra de cultivo tomada.



Extracción ADN Bacteriano

Escrito por KarolinaCepanauskaite 19-12-2017 en ExtADNbacteriano. Comentarios (0)

OBJETIVO:

Extraer ADN de una bacteria.


REACTIVOS:

-Tampón de Reacción Lisozima.

-Tampón de Lisis/Unión.

-Lisozima.

-Proteinasa K.

-Tampón de deshinibición.

-Tampón de lavado.

-Tampón de Elución.

-Isopropanol 

-Etanol 100%


MATERIALES:

-MicroSpin Columnas.

-Tubos de recogida.

-Microtubos de 1.5 ml.


PROCEDIMIENTOS:

-Se parte de 1-1,5 ml de medio de pre-enriquecimiento o enrequecimiento

-Transferirlo a un microtubo

-Centrifugar 5 minutos a 12.000-14.000 rpm

-Eliminar el sobrenadante.

-Añadir 280μl de Tampón de Reacción Lisozima y 20μl de Lisozima

-Mezclar bien con micropipeta para resuspender el pallet bacteriano

-Incubar a 37ºC durante 30 minutos.

-Añadir 300μl del Tampón de Lisis/Unión y 20μl de Proteinasa K

-Mezclar bien

-Incubar a 70ºC durante 10 minutos. Añadiremos 150μl de Isopropanol

-Mezclar bien y centrifugaremos 60 segundos a 14.000 rpm. 

-Añadir el sobrenadante en el reservorio de la Spin microcolumna con su tubo de recogida

-Centrifugar a 8.000 rpm durante 60 segundos

-Eliminar el tubo de reocogida.

-Colocar la microSpin columna en un tubo de recogida

-Añadir al reservorio 500μl de Tampón de Desinhibición

-Centrigugar a 8.000 rpm 60 segundos

-Eliminar el líquido.

-Añadir 500μl de Tampón de lavado en el reservorio de la Spin microcolumna

-Centrifugar a 12.000 rpm en 60 segundos

-Volver a eliminar el líquido.

-Hacer un segundo lavado añadiendo 500μl de Tampón de Lavado en el reservorio de la microSpin columna 

-Centrifugar a 12.000 rpm durante 60 segundos

-Eliminar el líquido. 

-Centrifugar a máxima velocidad durante dos minutos para eliminar el etanol residual.

-Eliminar el tubo de recogida e insertar la Spin microcolumna en un tubo de 1,5ml

-Añadir 100μl de Tampón de Elución (precalentado a 70ºC), en el reservorio de la spin microcolumna

-Incubar un minuto. 

-Centrifugar a máxima velocidad durante 60 segundos, el microtubo contiene ahora el ADN bacteriano.


RESULTADO:

La práctica ha salido en perfectas condiciones.











Extracción de ADN de Sangre

Escrito por KarolinaCepanauskaite 19-12-2017 en ExtADNsangre. Comentarios (0)

OBJETIVO:

Extraer ADN de una muestra de sangre.


REACTIVOS:

-Muestra de sangre (TIPO I)

-Tampón de lisis.

-NaCl 0,9%

-SDS 20%

-Proteinasa K 20 mg/ml

-NaCl saturado (6M)

-Etanol absoluto

-Etanol 70%


MATERIALES:

-2 microtubos

-1 tubo de fondo cónico 15ml

-1 varilla para capturar la madeja de ADN

-2 pipetas pasteur de 3 ml


PREPARACIÓN DE REACTIVOS:

En esta práctica habrá que preparar tampón de lisis, NaCl al 0,9%, NaCl saturado, SDS y etanol. 

En nuestro grupo prepararemos el SDS.

Reactivos.

- 2g de SDS

-Agua (para biología molecular) hasta 10ml.

Procedimientos.

-Coger 2g de SDS

-Añadir agua hasta 8ml

-Disolver en el agitador magnético con aplicación de calor suave.

-Una vez disuelto, enrasar a 10ml. 



EXTRACCIÓN DE ADN:

Procesos básicos de extracción de ADN:

1 Lisis celular. 

2 Separación del ADN del contenido celular: Protección frente a nucleasas.

3 Purificación del ADN.


-Añadir, a 2 ml de sangre periférica en EDTA, 10ml de Tampón de lisis

-Mezclar por inmersión.

-Dejar en la nevera a 4ºC durante 30 minutos

-Centrifugar 15 minutos a 2.500 rpm.

-Eliminar el sobrenadante con una pipeta pasteur

-Añadir NaCl al 0.9% hasta 4 ml

-Disolveremos completamente el precipitado. 

-Centrifugar 15 minutos a 2.500 rpm

-Volver a eliminar el sobrenadante con una pipeta pasteur.

-Añadir 500μl de Tampón de lisis, 25μl de SDS 20% y 2,5μl de proteinasa K

-Agitar con vórtex. 

-Incubaremos a temperatura ambiente toda la noche.

-Añadiremos 160μl de NaCl saturado,

-Vórtex.

-Añadir 2 volúmenes de etanol absoluto frío

-Mezclar por inversión muy lentamente observando la formación de ovillo de ADN precipitado

-Capturar la madeja con una varilla

-Lavarla en un microtubo con un 1ml de etanol 70%.

-Dejar secar el ADN en la varilla durante 30 minutos, apoyando la varilla sobre una gradilla.

-Pasar la varilla a un microtubo vacío

-Resuspenderla en 300μl de agua destilada estéril, obteniendo así una concentración de ADN promedia de 100-200ng/μl.


RESULTADOS:

No hemos logrado sacar el ovillo de ADN, posiblemente debido a que había poco ADN en la muestra que hemos recogido..




Danagene Saliva Kit

Escrito por KarolinaCepanauskaite 19-12-2017 en DanageneSaliva. Comentarios (0)


OBJETIVO:

Extraer ADN a partir de una muestra de saliva.


REACTIVOS:

-Saliva. (-Se recomienda que la persona que vaya a usar su saliva como muestra no haya comido nada durante los 30 minutos previos a la            toma de muestra.

         -A la hora de depositar la saliva en el tubo de recogida, deberá pasar la lengua por las paredes de las mejillas, mandíbulas y paladar         para recoger las células.)

-Tampón de Lisis.

-Tampón de precipitación proteínas. 

-Isopropanol.

-Etanol 70%.

-Tampón de hidratación.


PROCEDIMIENTOS:

Toma de muestras

-Depositar 1,5ml de saliva en un tubo de recogida, siguiendo los pasos indicados arriba. 

Lisis celular.

-Colocar 600-800μl de saliva en un tubo Eppendorf

-Centrifugar durante 90 segundos a 13.000-16.000 x g

-Eliminar el sobrenadante con una pipeta pasteur, sin tocar el pellet precipitado blanco. 

-Añadiremos 600μL de Tampón de Lisis

-Mezclar para resuspenderlo completamente, empleando la micropipeta

-Disolver el pellet de células y lisarlo.

-Incubar la muestra durante 10 minutos en el termobloque, con una agitación suave a 37ºC. 

Precipitación proteica.

-Añadir 200μL de Tampón de precipitación de proteínas al lisado celular

-Vórtex a máxima velocidad durante 20 o 30 segundos

-Centrifugar a 13.000-16.000 xg durante 5 minutos, con esto se formará un precipitado.

Precipitación del ADN.

-Traspasar el sobrenadante que contiene el ADN a un microtubo nuevo que contenga 600μL de Isopropanol

-Mezclar por inversión unas 25-50 veces.

-Centrifugar a 13.000-16.000 x g durante dos minutos. Se observará el ADN como un pellet blanco. 

-Eliminar el sobrenadante

-Secar el tubo de forma breve en un papel absorbente.

-Añadir 600μL de etanol al 70%  para así lavar el ADN. 

-Centrifugar a 13.000-16.000 x g durante un minuto

-Eliminar el sobrenadadante con  cuidado de no tocar el pellet de ADN

-Volver a centrifugar nuevamente para recoger las últimas gotas de etanol residual

-Con una micropipeta y punta fina recoger el etanol residual.

-Invertir el microtubo en un papel absorbente

-Dejar secar durante 5-10 minutos.

Hidratación del ADN.

-Añadir entre 100 y 750 μL de Tampón de hidratación, dependiendo del tamaño del pellet de ADN

-Resuspenderlo con la micropipeta.

-Para pallets muy pequeños usaremos entre 25 y 50 μL del tampón de hidratación.

-Conservar a 2-8ºC. Si vamos a realizar un almacenaje largo conservar a -20ºC o -80ºC.


RESULTADOS:

Hemos realizado la práctica hasta la precipitación de ADN, debido a un error al eliminar el sobrenadante que deberíamos haber introducido en el microtubo de isopropanol.