Biología Molecular & Citogenética

Cuaderno de Prácticas

Aquí se describen las prácticas realizadas en 1º de Laboratorio Clínico y Biomédico

Electroforesis

Escrito por KarolinaCepanauskaite 07-03-2018 en Electroforesis. Comentarios (0)

OBJETIVO:

Poder determinar que una persona es Rh+ o Rh-, ya que este método nos permite separar las hebras de ADN, pudiendo así observar las determinaciones de los genes presentes.


REACTIVOS:

-Colorante Danablue

-DNA Marker Shuman

-DNA Marker Beethove

-Agarosa

-Tampón de electroforesis 10X

-Agua destilada

-ADN

-Control + / Control - Rh


MATERIALES:

-Micropipetas + Puntas pipetas

-Matraz Erlenmeyer


EQUIPOS:

- Microondas

-Transiluminador de luz blanca

-Cubeta de electroforesis


PROCEDIMIENTOS:

Preparación del molde

-Coger el molde para hacer los geles y cerrar los extremos con los topes para que no se salga la agarosa. 

-Colocar el peine para formar los pocillos.

Preparación del gel de agarosa

1-Añadir 450ml de agua destilada al Tampón de electroforesis 10X

2-a)Para geles de 7x7 cm: En un tubo Erlenmeyer añadir 32g de Tampón de electroforesis 1X más 0.30g de agarosa.

    b)Para geles de 7x10 cm: Añadir 42g de Tampón de electroforesis 1X más 0.40g de agarosa.

*En algunos geles hemos echado colorante Danablue

3-Mezclar bien hasta disolver los grumos.

4-Calentar la mezcla en un microondas para disolver la agarosa. Llevar la solución punto de ebullición. La solución final debe aparecer clara y sin partículas aparentes.

5-Enfriar la solución de agarosa.

6-Añadir la solución de agarosa al molde.

7-Dejar que el gel solidifique.

Preparación del gel para la electroforesis

1-Sacar los topes del molde con mucho cuidado.

2-Colocar el gel en la cámara de electroforesis correctamente orientada con los pocillos más cerca del polo negativo (color negro).

3-Llenar la cámara de electroforesis con Tampón de electroforesis hasta cubrir totalmente el gel de agarosa. 

4-Sacar el peine, que ha formado los pocillos, con mucho cuidado de no romper ningún pocillo.

Siembra del gel y electroforesis

-Tenemos que sembrar pocillos con:

    ·ADN

    ·Control negativo

    ·Control positivo

    ·DNA Marker Shuman/ DNA Marker Beethoven (los cuales se pueden ir alternando)

 *Estos se han de sembrar de forma ordenada, apuntando en cada momento donde se ha sembrado cada.

 *Se ha de echar 20 μL en cada pocillo

 *Para sembrar en un gel al que no le hemos echado colorante Danablue: Tenemos que echar este colorante en las muestras.

Llevar a cabo la electroforesis

1-Colocar la cubierta del aparato de electroforesis en los terminales de los electrodos.

2-Insertar la clavija del cable negro en la entrada de color negro de la fuente de corriente (entrada negativa); e insertar la clavija del cable rojo en la entrada de color rojo de la fuente de corriente (entrada positiva).

3-Configurar la fuente de corriente a 75 voltios (30minutos) o a 150 voltios (20minutos). 

  Vigilar que los colorantes no salen fuera del gel.

4-Al terminar la electroforesis: apagar la fuente de corriente, desconectar los cables y sacar la cubierta.

5-Colocar el gel en un transiluminador de luz blanca.


RESULTADO:

La práctica no se ha realizado de forma correcta, ya que las muestras se habían salido de los pocillos al realizar la siembra. Esto ha podido ocurrir debido a que había mucha gente realizando la práctica y se ha movido demasiado el gel de agarosa (Movimiento de la mesa, choques...)


La primera imagen sería la correspondiente a lo observado con el marcador Shumann; y la segunda al marcador Beethoven.

 


Determinación del Factor Rh por PCR

Escrito por KarolinaCepanauskaite 03-03-2018 en PCR. Comentarios (0)

OBJETIVO:

Amplificar ADN (fragmento gen D) para determinar si una persona tiene un grupo sanguíneo Rh+ o Rh-

En los individuos Rh+ se han de observar 2 fragmentos de diferentes tamaños (1200pb y 600pb), mientras que en los Rh- solo se verá la banda correspondiente al fragmento 600pb.


REACTIVOS:

-Tampón de electroforesis 10X

-Agarosa

-Mix PCR (Polimerasa MIX Hot Star)

-Control Rh+

-Agua destilada


MATERIALES:

-Micropipetas

-Puntas con filtro


EQUIPOS:

-Termociclador

-Cabina de seguridad biológica

-Termobaño


PROCEDIMIENTOS:

Extracción de ADN a partir de una muestra de sangre.

Reacción de la PCR:

#Cambiar de punta de pipeta en cada paso.

#Realizar todo en la cabina de seguridad biológica.

1-Preparar la muestra a amplificar: Utilizar 2'5 μL de ADN

2-Preparar un control negativo de amplificación colocando 2'5 μL de agua libre de nucleasas en lugar de ADN.

3-Preparar un control positivo de amplificación colocando 2'5 μL de control positivo de Rh en lugar de ADN.

·Los reactivos serían: 22'5 μL de MIX PCR

                                   2'5 μL de ADN* 

4- Realizar el proceso de amplificación en termociclador, cuyo programa ha de ser:


PASO

TEMPERATURA

TIEMPO

Desnaturalización HOT STAR

95ºC

10 minutos


Ciclos PCR (Realizar 35 ciclos)


95ºC

64ºC

72ºC


30 segundos

30 segundos

45 segundos


Extensión final


72ºC


10 minutos


Final


4ºC






5- Sembrar directamente el producto de la PCR en un gel de agarosa, ya que el colorante rojo funciona como tampón de carga. Utilizar el método de detección/ tinción Danablue.

6-Observar las bandas y determinar si se ha contaminado alguna muestra/ si una persona es Rh+ o Rh-


RESULTADO:

De momento no se sabe si se ha realizado de forma correcta, ya que no hemos terminado de realizar la electroforesis. Lo más probable es que haya errores, ya que no se han vertido las muestras de forma correcta en el gel de agarosa.

Cariotipo en Sangre Periférica

Escrito por KarolinaCepanauskaite 03-03-2018 en Cariotipo. Comentarios (0)

OBJETIVO:

Analizar las características y número de cromosomas del ADN de una persona para saber si esta dispone de alguna anomalía numérica o estructural.


REACTIVOS:

-Muestra de sangre fresca en Heparina

-KCl

- Ácido acético glaciar

-Metanol

-Pastillas de Buffer pH 6.8

-Fitohemaglutinina

-Suero fisiológico

-Giemsa

-Colchicina

-Tripsina

-Agua destilada

-Medio de cultivo enriquecido


Material:

-Pipetas Pasteur

-Micropipetas

-Portaobjetos


Equipos:

-Centrífuga

-Estufa

-Cabina de seguridad biológica.


PROCEDIMIENTOS:

Preparación de Giemsa

Es el reactivo que hemos preparado lo de nuestro grupo. Otros han tenido que preparar 

-Solución de KCl

-Fijador Carnoy 

-Buffer pH 6.8

-Tripsina

·Hemos mezclado: -37'5 ml de Giemsa 

                               -337'5 ml de Buffer pH 6.8

·Se ha almacenado a temperatura ambiente.

Siembra de sangre periférica.

1- Añadir al medio de cultivo (descongelado) 0'25 ml de fitohemaglutinina y 0'4 ml de sangre (mezclándola previamente)

2- Agitarlo y mantenerlo en estufa a 37º, 72 horas.

Sacrificio de sangre. (En cabina de seguridad biológica)

3- Añadir 0'25 ml de colchicina.

4- Agitar suavemente y dejarlo 45 minutos en estufa a 37º.

5- Centrifugar 5 minutos a 1000 r.p.m. 

6- Eliminar el sobrenadante.

7- Choque hipotónico. Añadir 5 ml de KCl del siguiente modo:

        a) Añadir 1 ml y agitarlo suavemente hasta deshacer el botón de precipitación.

        b) Añadir 4 ml.

8- Centrifugar 5 minutos a 1000 r.p.m.

9- Eliminar el sobrenadante dejando 0'5 ml en el tubo.

10- Añadir 1 ml de fijador Carnoy y resuspender la solución.

11- Añadir 4 ml más de solución Carnoy.

12- Centrifugar 5 minutos a 1000 r.p.m.

           #Repetir los pasos 10, 11 y 12 hasta que esté limpio y blanco el precipitado, quedando el sobrenadante transparente.

13- Quitar el sobrenadante (dejando 0'5 ml) y resuspender.

14- Hacer extensiones sobre portaobjetos limpios:

          ·Mojar el porta con agua fría.

          ·Echar 4-5 gotas con la pipeta a 5-10 cm de altura del centro del porta, dejando resbalar la gota inclinando el porta para que se                  extienda por toda la superficie.

Bandeo y tinción de los cromosomas.

15- Preparar la solución de bandeo (mezclando tripsina con buffer)

16- Introducir el porta en tripsina durante 4-6 segundos.

17- Introducir inmediatamente el porta el solución tampón pH 6'8.

18- Se introduce el porta en la solución de Giemsa durante 2 minutos.

19- Se deja secar sin tocar la superficie donde están fijados los cromosomas.

Análisis al microscopio.

- Se buscan las metafases con el objetivo 10X

- Una vez encontrada una se añade una gota de aceite de inmersión a la precipitación y se visualiza con el objetivo 100X. 

         ·De este modo se puede contar el nº de cromosomas y comprobar que no tiene ninguna aneuploidía, y se pueden identificar                     algunos cromosomas como el 1, 2 y 3 por su gran tamaño y la posición del centrómero; el cromosoma 7 por su bandeo                             característico; o el cromosoma 21 e Y por ser los más pequeños.

- A partir de aquí, con más detenimiento y ayudándonos con una fotografía de lo observado, se puede realizar un cariotipo midiendo los índices centroméricos de cada cromosoma.


RESULTADO:

Se ha obtenido el resultado deseado.



Criopreservación

Escrito por KarolinaCepanauskaite 19-12-2017 en Criopreservación. Comentarios (0)

OBJETIVO:

Aprender a congelar células, previamente cultivadas, en un congelador de -80ºC y criopreservarlas después en nitrógeno líquido. 


REACTIVOS:

-Medio de Congelación: FBS, DMSO

-EtOH 70%


MATERIALES:

-Pipetas graduada y auxiliar de pipeteado

-Micropipetas

-Tubos falcon

-Unidades de filtración de distintos volúmenes.

-Tubos y cajas de criopreservación.

-Gradilla para tubos.


EQUIPO:

-Centrífuga


PROCEDIMIENTOS:

-Encender previamente la cabina de flujo laminar y desinfectar con etanol 70%. 

Preparación del medio de congelación.

-Consiste en FBS al que se añade un 10% de DMSO. Este paso se puede llevar a cabo fuera de la cabina de flujo laminar.

-Filtrar el medio de congelación.

-Almacenar en frío y sacar justo antes de resuspender las células en él. 

Recuento celular.

El recuento celular, la concentración y la viabilidad celular se realizarán como vienen descritas en la práctica anterior de conteo. 

Cálculos para determinar el número de viales a congelar. 

-Por lo general se congelarán del orden de 3,5x10^6 de células por vial.

-Para calcular el número de viales a congelar por cultivo, se calculará el número total de células y posteriormente se dividirá entre el número de células por vial.

Criopreservación de células. 

-Una vez calculado el número de viales y de células por vial para la criopreservación, se procede a a misma: 

-Primero se deben etiquetar lo viales de cripreservación, e introducir el cltivo en tubo falcon de 15mL.

-Centrifugar 80x g durante 8 minutos

-Introducir los tubos en la cabina de flujo laminar previamente pulverizados con etanol 70%.

-Con un pipeta pasteur quitar todo el sobrenadante. 

-Resuspender el pellet en el volumen de medio de congelación necesario (1mL de medio de congelación vial).

-Con una pipeta serológica tomar todo el volumen y añadirlo al vial de criopreservación.

-Introducir los viales en el congelador de -20ºC durante 4-5 horas.

-Meter los viales en una de las cajas de criopreservación y llevarlos al congelador de -80ºC o al Deward de nitrógeno líquido.


RESULTADOS:

La práctica salió en buenas condiciones.



Conteo, Concentración y Viabilidad Celular

Escrito por KarolinaCepanauskaite 19-12-2017 en CámaraNeubauer. Comentarios (0)
OBJETIVO:

Calcular la concentración y viabilidad de un cultivo celular.


REACTIVOS:

-Muestra de cultivo

-Disolución al 0.4% de azul tripán

-Dilución PBS


MATERIALES:

- Cámara de Neubauer

- Un contador manual.

-Pipeta serológica graduada de 5.10ml ó 25ml 

-Auxiliar de pipeteado

-Micropipetas según la cantidad que se necesite.

-Tubos Eppendorf.

-Gradilla para tubos


EQUIPOS:

-Cabina de flujo laminar

-Microscopio óptico invertido


PROCEDIMIENTOS:

-Encender la cabina de flujo laminar y desinfectarla con el etanol 70%. 

-Tomar 2μL de muestra de cultivo y añadirlo a un tubo eppendorf, donde se añaden 18μL dilución PBS. Todo ello en la cabina de flujo

laminar. 

-El siguiente paso ya se realiza fuera de la cabina de flujo laminar: añadir 20 μL de azul tripán

-Resuspender con cuidado. 

-Colocar la cámara horizontalmente sobre la mesa

-Añadirle 10μL de la muestra.

-Colocar la punta de la micropipeta en el borde del cubreobjetos, e introducir la muestra entre la cámara y el cubreobjetos desde el lateral.

-Colocar la cámara en la platina del microscopio y enfocarlo hasta que puedan verse nítidas las células.

-Buscar el primer cuadro donde se realice el recuento. (Nosotros decidiremos dónde empezar a contar y de qué forma lo haremos.)

-Contar las células viables, las que están sin teñir o blancas, y las no viables o muertas teñidas de azul. 


La determinación de la concentración celular viene definida por la siguiente ecuación: 

Concentración (células/mL) = (Nº de células por 1000 x factores dilución) / (Nº de cuadros)

La viabilidad celular, viene definida por la ecuación:

Viabilidad celular (OBJETIVO:%)= (Nº de células viables / Nº de células totales) x 100


RESULTADOS:

A nosotras nos ha salido un número muy elevado de células por cada cuadrito de la cámara Neubauer, lo que significa que teniamos que haber echado una mayor cantidad de dilución PBS a la muestra de cultivo tomada.